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蛋白质分离是生物化学和分子生物学研究中的一项基本技术#xff0c;用于根据蛋白质的物理和化学特性将其从混合物中分离出来。
1. 离心分离法
离心分离法利用离心力来分离不同质量或密度的颗粒和分子。
差速离心#xff1a;通过逐…一蛋白质化学
蛋白质分离是生物化学和分子生物学研究中的一项基本技术用于根据蛋白质的物理和化学特性将其从混合物中分离出来。
1. 离心分离法
离心分离法利用离心力来分离不同质量或密度的颗粒和分子。
差速离心通过逐渐增加离心力首先沉淀下大颗粒然后是小颗粒。速率区域离心利用颗粒在离心力作用下沉降速度的差异进行分离。平衡密度梯度离心在离心管中形成密度梯度颗粒根据其密度在梯度中达到平衡位置。蔗糖密度梯度离心使用蔗糖溶液形成密度梯度用于分离细胞器或其他颗粒。
2. 液相色谱法
液相色谱法是一种柱层析技术通过不同的相互作用力来分离蛋白质。
离子交换色谱基于蛋白质表面电荷与固定相上的相反电荷之间的相互作用。分为阳离子交换正电荷蛋白质吸附和阴离子交换负电荷蛋白质吸附。分子筛色谱根据蛋白质的分子大小进行分离小分子通过固定相大分子被排除在外。亲和层析利用蛋白质与特定配体如抗体、激素或底物类似物之间的高亲和力进行分离。
3. 电泳分离法
电泳分离法根据蛋白质的电荷和/或大小进行分离。
SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS是一种去污剂使蛋白质带负电荷并掩盖其大小差异从而根据大小进行分离。2D凝胶电泳结合等电聚焦根据等电点分离和SDS-PAGE根据大小分离用于分离蛋白质的复杂混合物。
4. 高度特异性的酶和抗体测定
这些方法用于检测和纯化单个蛋白质。
免疫印迹在电泳分离后将蛋白质转移到膜上然后用特异性抗体检测目标蛋白质。免疫沉淀利用抗体与目标蛋白质的特异性结合通过沉淀抗体-蛋白质复合物来纯化蛋白质。
5. 蛋白质的三维结构测定
这些技术用于确定蛋白质的三维结构。
X射线晶体学通过测量蛋白质晶体对X射线的衍射模式来确定其三维结构。低温电子显微镜在低温下使用电子显微镜观察蛋白质的二维图像然后通过计算方法重建三维结构。核磁共振波谱利用核磁共振技术测量蛋白质中原子核的磁共振频率以确定其三维结构。
6. 质谱法
质谱法是一种用于确定蛋白质分子量和序列的方法。
质谱通过电离蛋白质并根据其质荷比m/z分离离子然后检测和分析这些离子以确定蛋白质的分子量和序列。
7. 放射性同位素
放射性同位素在生物分子检测中仍然有其应用尤其是在追踪代谢途径和研究蛋白质合成方面。
这些方法各有优势和局限性通常需要根据实验目的和蛋白质的特性来选择最合适的分离技术。 二蛋白质结构与功能 多肽的形成和稳定性受到多种分子间力的影响对这些力的详细解释以及它们如何影响多肽和相关生物学过程的描述
1. 共价键Covalent Bonds
肽键Peptide Bonds连接氨基酸残基的酰胺键具有部分双键性质是多肽链的主要结构单元。肽键的典型距离约为1.5 Å键解离自由能约为356 kJ/mole。二硫键Disulfide Bonds由两个半胱氨酸残基的硫原子形成增强多肽链的稳定性。典型距离约为2.2 Å键解离自由能约为167 kJ/mole。
2. 离子键Ionic Bonds
盐桥Salt Bridges由带相反电荷的氨基酸残基如赖氨酸和天冬氨酸形成有助于多肽链的折叠和稳定。典型距离约为2.8 Å键解离自由能取决于盐桥的埋藏程度可能在12.5-17 kJ/mole之间。
3. 氢键Hydrogen Bonds
氢键由氢原子与电负性原子如氧或氮之间的吸引形成对多肽链的二级结构如α螺旋和β折叠至关重要。典型距离约为3.0 Å键解离自由能在水环境中为2-6 kJ/mole如果供体或受体带电则可能更高。
4. 范德华力Van der Waals Interactions
范德华力非极性氨基酸残基之间的弱吸引力对多肽链的三维结构稳定性有贡献。作用距离较短典型距离约为3.5 Å键解离自由能约为4 kJ/mole且随着距离的增加迅速减小。
5. 疏水相互作用Hydrophobic Interactions
疏水相互作用非极性氨基酸残基倾向于避免与水接触这种趋势推动它们聚集在一起有助于多肽链的折叠。这种力在多肽链的内部区域尤为显著对蛋白质的稳定性和功能至关重要。
6. 长程静电相互作用Long-range Electrostatic Interactions
长程静电相互作用依赖于介质的介电常数在水中被屏蔽具有1/r的依赖性。这种力在非极性区域可能非常强但在水环境中非常弱。
这些力共同作用决定了多肽链的折叠、稳定性和功能。例如氢键和二硫键在稳定蛋白质的二级结构中起关键作用而离子键和疏水相互作用则有助于蛋白质的三级结构形成。范德华力虽然较弱但在蛋白质内部的稳定性中也发挥着重要作用。长程静电相互作用在调节蛋白质的溶解性和相互作用中也扮演着角色。
在生物学过程中这些力的平衡对于蛋白质的正确折叠、稳定性和功能至关重要。例如错误折叠的蛋白质可能导致功能丧失或疾病。通过理解这些力科学家可以设计药物来干预蛋白质的折叠过程治疗相关疾病。 三核酸的结构与功能 根据您提供的图片内容以下是siRNA小干扰RNA和miRNA微RNA的详细介绍以及它们之间的异同点分析
miRNA微RNA
miRNA是一类内源性的小型非编码RNA分子通常由18-25个核苷酸组成。它们在调控基因表达中发挥重要作用特别是在转录后调控中。
miRNA的生成过程
初级转录本pri-miRNA由RNA聚合酶II和III转录产生具有发夹环结构。前体miRNApre-miRNA在细胞核内由Drosha和DGCR8酶处理pri-miRNA形成具有茎环结构的约70个核苷酸长的pre-miRNA。核输出pre-miRNA通过Exportin5和Ran-GTPase输出到细胞质。成熟miRNA在细胞质中Dicer酶进一步切割pre-miRNA形成成熟的双链miRNA。RNA诱导的沉默复合体RISC成熟的miRNA单链被整合到RISC中其中miRNA的引导链与目标mRNA结合。
miRNA的作用机制
miRNA与目标mRNA不完全互补配对主要通过抑制mRNA的翻译来调控基因表达。miRNA的2-7位核苷酸种子序列对于特异性识别目标mRNA至关重要。
siRNA小干扰RNA
siRNA是一类外源性的小型双链RNA分子通常由21-23个核苷酸组成。它们在RNA干扰RNAi途径中发挥作用用于沉默特定基因。
siRNA的生成过程
双链RNAdsRNA可以是外源性引入的也可以是内源性产生的。Dicer酶切割Dicer酶将双链RNA切割成21-23个碱基对的siRNA片段。RISC复合体siRNA被整合到RISC中单链siRNA引导RISC识别并切割含有互补序列的mRNA。
siRNA的作用机制
siRNA与目标mRNA完全互补配对导致mRNA的切割和降解从而抑制基因表达。
miRNA与siRNA的异同点分析
来源不同 miRNA来自基因组内编码的较长的初级转录本pri-miRNA。siRNA可以来自外源性双链RNA或内源性双链RNA。 作用结果不同 miRNA的“种子序列”位于5’端的2-7位核苷酸与目标mRNA不完全配对主要导致翻译抑制。siRNA与目标mRNA完全配对导致mRNA的降解。 功能相似性 两者都通过RISC复合体发挥作用调控基因表达。 应用差异 miRNA在生物体内广泛存在参与多种生物学过程。siRNA常用于实验室研究中作为基因沉默的工具。
通过这些机制miRNA和siRNA在调控基因表达、参与细胞分化、发育以及疾病发生等方面发挥着重要作用。 四DNA复制、转录 DNA修复途径是细胞维护基因组稳定性和完整性的关键机制。以下是各主要DNA修复途径的详细解释与分析
1. 直接修复机制
直接修复机制无需替换整个碱基或核苷酸而是通过直接修复受损的碱基来恢复DNA的正常结构。
MGMT甲基鸟嘌呤甲基转移酶该酶能够直接将6号位置的甲基CH₃O⁶-甲基鸟嘌呤移除恢复鸟嘌呤的正常结构。光裂合酶存在于细菌中能够修复由紫外线引起的嘧啶二聚体直接将受损的DNA或核苷酸还原不需要另一股作为修复模板。
2. 碱基切除修复BER
碱基切除修复用于清除并修复异常或不应存在的碱基防止在DNA复制过程中引发点突变。
该机制通过识别并切除受损碱基随后通过DNA聚合酶和DNA连接酶来填补缺失的碱基。BER主要针对单个碱基的损伤如氧化损伤、脱胺等。
3. 核苷酸切除修复NER
核苷酸切除修复主要修复影响大片区域染色体结构的DNA损伤如嘧啶二聚体、DNA附加物和DNA交互连结等。
NER分为两种类型
全基因组NERGG-NER通过XPC-HR23B双合体识别全基因组范围内的DNA损伤启动修复路径。转录合并修复TCR当RNA聚合酶在转录过程中遇到无法辨识的核苷酸损伤而停滞时激活的修复机制。TCR能迅速招募NER相关修复蛋白优先修复转录活跃区域的DNA损伤。
4. 错误配对修复MMR
错误配对修复负责校正DNA复制过程中发生的嘌呤-嘧啶错误配对减少突变率。
MMR通过识别并切除错误配对的碱基然后利用正确的模板链进行修复确保基因组的准确复制。
5. 单股DNA断裂修复SSBR
单股DNA断裂修复机制与碱基切除修复使用相似的蛋白质因此有时将其归入BER路径内。
该修复机制主要处理由于各种内外源因素引起的单链DNA断裂恢复DNA的连续性和完整性。
6. 同源性重组HR
同源性重组修复依赖于细胞内的同源染色体或姊妹染色分体作为修复模板以恢复DNA双股断裂。
HR在细胞周期的S期和G2期更为活跃因为此时姊妹染色分体可作为高保真模板减少修复过程中引入的错误。
7. 非同源性末端接合NHEJ
非同源性末端接合无需模板直接将双股断裂的DNA末端连接起来。
虽然NHEJ修复速度快但由于缺乏模板其修复过程可能导致序列的插入或缺失增加基因突变的风险。NHEJ在复杂基因组中较为活跃也在免疫系统的V(D)J重组过程中发挥重要作用。
总结
不同的DNA修复途径各有其特定的修复目标和机制协同作用以维护基因组的稳定性和细胞的正常功能。直接修复和BER主要处理小范围的碱基损伤而NER则处理更大范围的结构损伤。MMR和SSBR则负责纠正复制错误和单链断裂。对于最为严重的双链断裂HR和NHEJ提供了高保真和快速修复的选择分别适应不同的细胞周期阶段和生物学需求。
Sources: https://zh.wikipedia.org/wiki/DNA%E4%BF%AE%E5%BE%A9 五生物大分子相分离 以下是每个实验的详细解释
1. 相分离实验Phase Separation Assays
相分离实验用于研究生物大分子如蛋白质和RNA在特定条件下的相行为。实验步骤如下
荧光标记使用荧光染料标记蛋白质或RNA。相分离诱导通过改变浓度、温度、pH值、盐和溶质、RNA/DNA/配体的序列/结构等条件诱导相分离。液滴形成观察到荧光标记的生物分子形成液滴。液滴特性分析分析液滴的数量、大小和形态。溶解使用解聚酶、RNA酶或1,6-己二醇1,6-HD等试剂溶解液滴。多色标记使用不同颜色的荧光标记来研究混合物的相容性、不相容性或多相结构。
2. FRAP荧光恢复后光漂白
FRAP用于测量荧光分子在光漂白后的恢复动力学反映分子的流动性。
光漂白使用激光照射特定区域使荧光分子失去荧光。恢复观察监测漂白区域荧光的恢复。恢复动力学根据荧光恢复的速度可以推断出分子的流动性和交换速率。
3. 液滴融合Droplet Fusion
液滴融合实验用于研究液滴之间的融合特性。
自由融合液滴在没有外力作用下自然融合。光镊使用光镊技术操纵液滴增加融合频率。剪切应力通过施加剪切应力促进液滴融合。融合动力学观察融合过程分析融合的速率和效率。
4. 基于沉降的LLPS测定Sedimentation-based LLPS Assay
LLPS液-液相分离测定用于研究蛋白质或蛋白质复合物的相分离行为。
混合复合物制备蛋白质或蛋白质复合物的混合溶液。离心通过离心分离上清液S和沉淀物P。洗涤洗涤沉淀物以去除未结合的分子。SDS-PAGE分析使用SDS-PAGE分析上清液和沉淀物中的蛋白质分布。
5. 微流变学Microrheology
微流变学用于测量软物质如生物大分子溶液的流变性质。
荧光标记使用荧光标记的微珠作为探针。追踪运动追踪微珠在溶液中的运动。扩散分析分析微珠的均方位移与时间的关系区分自由扩散和受限/粘弹性扩散。
6. 表面张力Surface Tension
表面张力测量用于研究液滴的表面特性。
直角成像使用显微镜观察液滴的形态。表面润湿测量液滴在不同表面上的接触角。表面张力拟合根据液滴的高度和半径拟合表面张力。
这些实验方法为研究生物大分子的相行为、流动性、融合特性以及流变性质提供了有力的工具。通过这些实验可以深入理解生物大分子在细胞内的行为以及它们如何参与细胞功能和疾病过程。
根据您提供的图片内容以下是细胞过程中液液相分离LLPS的详细解释参考RNA颗粒、信号传导、细胞粘附等生物学过程并考虑LLPS的调控因素
1. 液液相分离的预测与特征确定
预测利用生物信息学工具预测蛋白质中可能参与相分离的区域。2D/3D介质在二维或三维介质中进行实验以确定蛋白质的相分离特性。
2. 细胞内无膜细胞器MLOs的详细成像
分子扩散与交换研究分子在MLOs中的扩散和交换特性如融合、荧光恢复后光漂白FRAP等。大小与形态观察MLOs的大小和形态以及它们在细胞内的时空分布。
3. MLOs的组成与功能
识别MLOs的组分区分MLOs的支架蛋白和客户蛋白。体外重建在体外条件下重建MLOs研究其形成和功能。
4. MLOs的功能
组成型在细胞中持续存在的MLOs。信号控制响应特定信号而形成的MLOs。应激诱导在细胞应激条件下形成的MLOs。
5. 相分离的驱动力
多价性来自串联结构域、低复杂度序列LCDs和客户蛋白的多价性。相分离的介导确定介导相分离的关键因素。
6. 相分离的调控
翻译后修饰PTM如磷酸化、泛素化等可以影响蛋白质的相分离行为。pH值细胞内pH值的变化可以影响蛋白质的电荷状态进而影响相分离。氧化还原状态细胞内的氧化还原平衡可以调节蛋白质的相分离。反馈循环细胞内的反馈机制可以调节相分离过程维持细胞内环境的稳定。
7. 相分离与生物功能的联系
遗传操作通过敲除或突变关键组分研究其对相分离的影响。凝聚体的破坏使用1,6-己二醇1,6-HD等试剂破坏凝聚体观察细胞功能的变化。功能恢复通过嫁接grafting技术恢复功能验证相分离在细胞功能中的作用。
8. 相分离的实验验证
体外和体内实验通过体外和体内实验验证相分离的特征。相图构建相图展示不同条件下相分离的状态。
9. 光遗传学工具的应用
光控凝聚体使用光遗传学工具如光敏蛋白实现对凝聚体形成和解聚的精确控制。
通过这些步骤研究人员可以深入理解液液相分离在细胞生物学过程中的作用以及如何通过调控相分离来影响细胞功能。这对于研究RNA颗粒、信号传导、细胞粘附等生物学过程具有重要意义。 六糖生物学概论 10种糖链修饰就有10种糖基转移酶 七生物正交化学与糖链标记技术 1click chemistry
最后一章节
第一代可能不适合于用来做动物活体实验
一价铜离子催化
Click反应概述
Click反应是一种高效的化学偶联反应广泛应用于生物标记、药物合成和材料科学等领域。以下是对第一代、第二代和第三代Click反应的详细解释和分析
第一代Click反应CuAAC (Copper-catalyzed Azide-Alkyne 1,3-dipolar Cycloaddition)
反应机制
叠氮化合物Azide与末端炔Terminal Alkyne在Cu(I)催化下进行1,3-偶极环加成反应生成1,4-二取代1,2,3-三唑。
优点
高产率、高区域选择性、广泛的底物适用性。反应条件温和室温、常压。
缺点
需要Cu(I)催化剂可能对生物体系有毒。在体内易产生活性氧ROS具有细胞毒性。
应用场景
体外细胞实验成像、蛋白质组学等。
改进
使用配体稳定Cu(I)加速反应降低Cu的毒性。
第二代Click反应SPAAC (Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition)
反应机制
利用环辛炔Cyclic Alkyne中的环张力与叠氮化合物在无铜条件下迅速发生23环加成反应。
优点
无铜催化避免了Cu(I)的细胞毒性问题。快速反应适用于活体成像。
缺点
需要特定的环辛炔底物底物合成可能较复杂。
应用场景
活体动物成像。
第三代Click反应IEDDA (Inverse Electron-Demand Diels-Alder Cycloaddition)
反应机制
四嗪Tetrazine与反式环辛烯TCO进行逆电子需求型Diels-Alder反应生成稳定的四嗪-环辛烯加合物。
优点
高生物相容性无需催化剂快速反应。反应条件温和适用于低浓度蛋白质修饰。
缺点
需要特定的四嗪和TCO底物。
应用场景
蛋白质修饰、活体成像。
比对分析
特性CuAACSPAACIEDDA催化剂Cu(I)无无底物叠氮和末端炔叠氮和环辛炔四嗪和TCO反应条件室温、常压室温、常压室温、常压细胞毒性有无无应用场景体外实验活体成像蛋白质修饰、活体成像
生物学课题设计
课题名称 利用Click反应进行活体肿瘤成像和蛋白质组学研究
研究目标
利用SPAAC反应在活体小鼠中进行肿瘤成像以评估肿瘤的生长和扩散。通过IEDDA反应对肿瘤组织中的特定蛋白质进行修饰以研究其在肿瘤发展中的作用。
实验步骤
合成带有叠氮或四嗪标记的肿瘤靶向分子。将标记分子注射到肿瘤小鼠模型中。使用荧光探针通过SPAAC或IEDDA反应与标记分子结合进行活体成像。收集肿瘤组织样本通过IEDDA反应对特定蛋白质进行修饰进行蛋白质组学分析。
预期结果
获得高分辨率的肿瘤成像结果揭示肿瘤的微观结构和动态变化。鉴定与肿瘤发展相关的关键蛋白质为肿瘤治疗提供新的靶点。
创新点
结合两种Click反应实现从活体成像到分子层面的全面研究。利用无铜催化的Click反应减少对生物体系的干扰提高实验的生物相容性。 八糖免疫 本卷为开卷考试但禁止联网查询在监考期间倒是见到了一些学生 1首先对照该大纲看题目范围在哪里迅速定位
该大纲里有的就直接写上去
2没有的再到对应章节里wps ai查询有道翻译截屏抄写
3综上都没有办法的再googlemax ai侧边栏同时开kimi chat
